CNSH. Lê Thị Quỳnh – IVFMD SIH - Bệnh viện Phụ sản Quốc tế Sài Gòn
 
TỔNG QUAN
Công nghệ hỗ trợ sinh sản (Assisted reproductive technologies - ART), đặc biệt là thụ tinh trong ống nghiệm (In vitro fertilization - IVF), đã đạt được những thành công đáng kể, giúp hàng triệu cặp vợ chồng hiếm muộn có con. Tuy nhiên, bên cạnh những lợi ích rõ ràng, các nghiên cứu gần đây đã đặt ra những câu hỏi về tác động lâu dài của ART đối với sức khỏe của trẻ em sinh ra bằng phương pháp này.
Một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng trẻ sinh ra bằng ART có thể có nguy cơ cao hơn mắc một số vấn đề sức khỏe, bao gồm: (1) Rối loạn tăng trưởng: Trẻ sinh ra bằng ART có thể có mô hình tăng trưởng khác biệt so với trẻ được sinh ra tự nhiên, (2) Rối loạn chuyển hóa: Các nghiên cứu đã ghi nhận tỷ lệ cao hơn các vấn đề về chuyển hóa lipid, rối loạn chức năng tim chuyển hóa và tăng huyết áp ở trẻ sinh ra bằng ART, (3) Rối loạn thần kinh: Một số nghiên cứu nhỏ đã báo cáo tỷ lệ mắc bệnh bại não cao hơn ở trẻ sinh ra bằng ART. Các kết quả trên đã dấy lên lo ngại về sự an toàn của ART và nhấn mạnh tầm quan trọng của việc theo dõi sức khỏe lâu dài của trẻ sinh ra bằng phương pháp này. Các nhà khoa học đang tiếp tục nghiên cứu để làm rõ cơ chế gây ra những vấn đề sức khỏe này và tìm ra các biện pháp can thiệp sớm.
Điều kiện nuôi cấy phôi, đặc biệt là nồng độ oxy, có thể gây ra những căng thẳng khác nhau cho phôi, dẫn đến những thay đổi về sức khỏe của cá thể trong tương lai. Cụ thể, việc sử dụng nồng độ oxy sinh lý (5%) hoặc khí quyển (20%) trong nuôi cấy phôi người đã gây nhiều tranh cãi. Nghiên cứu cho thấy rằng nồng độ oxy thấp có thể cải thiện đáng kể tỷ lệ thành công của IVF, trong khi nồng độ oxy cao có thể gây ra tổn thương oxy hóa cho phôi. Vì vậy, một câu hỏi quan trọng được đặt ra: “Làm thế nào quá trình trao đổi chất của phôi thay đổi sau khi được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo?”.
Phôi trước khi làm tổ có quá trình trao đổi chất đặc biệt, khác biệt so với các tế bào trưởng thành. Chu trình Krebs là nguồn năng lượng chính trong suốt giai đoạn tiền làm tổ, trong đó phôi chủ yếu sử dụng đường phân để sản xuất năng lượng, ngay cả khi có đủ oxy. Hiện tượng này được gọi là chuyển hóa Warburg. Quá trình chuyển hóa Warburg được thúc đẩy bởi một nhóm enzyme đặc biệt, giúp chuyển đổi pyruvate thành lactate.
Với những kết quả hiện có, nhóm tác giả tìm cách hiểu rõ hơn về quá trình trao đổi chất ở phôi chuột được tạo ra in vivo hoặc in vitro. Các phôi nang được tạo ra in vivo sau khi giao phối được sử dụng làm đối chứng (nhóm phôi nang đã rửa sạch - FB). Hai nhóm thử nghiệm đã được sử dụng: Nhóm IVF 5%: Phôi IVF được nuôi cấy đến giai đoạn phôi nang trong môi trường tối ưu (KSOM) với nồng độ oxy 5%. Nhóm IVF 20%: Phôi IVF được nuôi cấy trong môi trường tương tự nhưng với nồng độ oxy 20%. Các thông số được đánh giá bao gồm: (1) Stress oxy hóa: Bao gồm mức độ các gốc tự do (Reactive Oxygen Species - ROS), dấu hiệu tổn thương oxy hóa trên phôi và nồng độ glutathione. (2) Chức năng ty thể và đường phân: Sử dụng máy phân tích Seahorse XF HS Mini để đo tiêu thụ oxy, sản xuất ATP, hoạt động đường phân, nồng độ lactate, pyruvate và pH của phôi. (3) Phân tích toàn bộ proteome: Xác định các protein được biểu hiện khác nhau giữa các nhóm phôi.
Kết quả cho thấy phôi IVF, đặc biệt là nhóm nuôi cấy ở nồng độ oxy 20%, có những thay đổi đáng kể trong quá trình trao đổi chất so với phôi phát triển tự nhiên. Những phát hiện này cung cấp cơ sở cơ chế liên kết giữa điều kiện nuôi cấy và trạng thái trao đổi chất của phôi, đồng thời có thể hữu ích trong việc lựa chọn phôi có khả năng phát triển thành công cao hơn.
 
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Các thí nghiệm trên động vật đã được Ủy ban Chăm sóc và Sử dụng Động vật của Viện Đại học California, San Francisco chấp thuận. Tất cả động vật đều được nuôi theo quy định của viện trong chu kỳ sáng/tối 12 giờ với đầy đủ thức ăn và nước uống.
Phương pháp thực nghiệm:

• Chuột: Sử dụng chuột cái CF1 (8-9 tuần tuổi) và chuột đực B6D2F1 (8-9 tuần tuổi).
• Siêu phóng noãn: Chuột cái được tiêm PMSG và hCG để kích thích rụng trứng.
• Thu thập noãn và tinh trùng: Noãn được thu thập từ ống dẫn trứng và tinh trùng được thu thập từ mào tinh hoàn.
• IVF: Tinh trùng và noãn được nuôi cấy cùng nhau trong môi trường HTF để tạo thành hợp tử.

Nuôi cấy phôi:

• Điều kiện nuôi cấy: Hợp tử được nuôi cấy trong môi trường KSOM ở 37°C, 5% CO2.
• Các nhóm nghiên cứu:
  • Nhóm IVF 5%: Phôi được nuôi cấy trong môi trường có 5% oxy.
  • Nhóm IVF 20%: Phôi được nuôi cấy trong môi trường có 20% oxy.
  • Nhóm đối chứng (FB): Phôi được thu thập từ chuột mang thai tự nhiên.
• Đồng bộ hóa phát triển: Chỉ sử dụng các phôi nang có hình thái tương tự để đảm bảo so sánh chính xác giữa các nhóm.

Các điều kiện nuôi cấy được kiểm soát chặt chẽ để đảm bảo tính nhất quán và loại bỏ các yếu tố nhiễu.
Đánh giá sự phát triển của phôi và đếm tế bào
Phôi được nuôi cấy trong các điều kiện oxy khác nhau (5% và 20%) để theo dõi tốc độ phân chia và hình thành phôi nang. Tại các thời điểm cụ thể, phôi được nhuộm bằng thuốc nhuộm huỳnh quang để đếm số lượng tế bào.
Đánh giá mức độ GSH/ROS trong phôi nang và môi trường nuôi cấy
Sử dụng các thuốc nhuộm huỳnh quang H2DCFDA và CMF2HC để đo lượng các gốc tự do (ROS) và chất chống oxy hóa (GSH) trong tế bào phôi.
Để xác định ROS trong môi trường nuôi cấy, nhóm tác giả sử dụng bộ xét nghiệm Oxiselect. Sau khi xử lý mẫu nuôi cấy và thêm chất xúc tác, cường độ huỳnh quang được đo bằng máy đọc đĩa huỳnh quang.
Miễn dịch huỳnh quang
Sử dụng kháng thể đặc hiệu để phát hiện các dấu ấn sinh hóa của stress oxy hóa (như 8-OHdG, PGF2 alpha, DNPH) và đánh giá hoạt động của các enzyme liên quan đến chuyển hóa năng lượng (MCT1, LDHA, LDHB) trong phôi nang.
Phân tích chuyển hóa
Đo lường trực tiếp các thông số chuyển hóa như tốc độ tiêu thụ oxy (OCR), tốc độ ngoại bào axit hóa (ECAR), nồng độ ATP, pyruvate và lactate để đánh giá chức năng của ty thể và đường phân.
Đo pH
Đo pH nội bào và ngoại bào để đánh giá cân bằng axit-base trong tế bào và môi trường nuôi cấy.
Đo nồng độ nicotinamide adenine dinucleotide (NAD)
Đánh giá trạng thái năng lượng tế bào thông qua đo nồng độ NAD.
Phân tích proteomic
Sử dụng khối phổ để xác định sự thay đổi về biểu hiện protein toàn bộ trong phôi nang.
Western blotting
Xác nhận sự thay đổi biểu hiện của một số protein mục tiêu.
 
KẾT QUẢ
Các phôi được tạo ra bằng IVF phát triển chậm hơn so với phôi tự nhiên, đặc biệt ở giai đoạn phôi nang. Đồng thời, các phôi này cũng chịu nhiều tổn thương do oxy hóa hơn. Chỉ những phôi nang phát triển tốt mới được chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, kết quả cho thấy phôi IVF phát triển chậm hơn khi nuôi cấy trong môi trường có nồng độ oxy cao (20%). Số lượng tế bào trong phôi IVF cũng ít hơn so với phôi tự nhiên.
Các thay đổi về hình thái và tốc độ phát triển này đi kèm với sự gia tăng đáng kể các gốc tự do (ROS) trong phôi IVF, đặc biệt là ở những phôi được nuôi cấy trong môi trường giàu oxy. Đồng thời, lượng glutathione (GSH), một chất chống oxy hóa quan trọng, giảm đi đáng kể ở các phôi này. Điều này cho thấy phôi IVF đang phải đối mặt với tình trạng stress oxy hóa nghiêm trọng.
Các phôi nang được tạo ra bằng IVF cho thấy hoạt động của ty thể giảm và hoạt động của quá trình phân giải đường tăng lên, một hiện tượng được gọi là hiệu ứng Warburg. Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng phôi nang IVF thường có các bất thường về ty thể. Để tìm hiểu rõ hơn về hậu quả của tình trạng stress oxy hóa đối với phôi, nhóm tác giả đã đo lường hoạt động của ty thể (tốc độ tiêu thụ oxy) và quá trình phân giải đường (tốc độ sản xuất proton và axit hóa môi trường). Kết quả cho thấy phôi IVF có hoạt động của ty thể thấp hơn so với phôi tự nhiên, bao gồm cả khả năng sản xuất ATP và đạt mức tiêu thụ oxy tối đa. Hiện tượng này đặc biệt rõ rệt ở những phôi IVF được nuôi cấy trong môi trường giàu oxy.
Phôi được tạo ra từ IVF cho thấy sự thay đổi về độ pH nội bào/ngoại bào, NAD, lactate và mức pyruvate. Bên cạnh đó, phôi được tạo ra từ IVF cho thấy sự thay đổi trong các enzyme liên quan đến quá trình chuyển hóa lactate. Vì lactate đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa năng lượng của tế bào, nhóm tác giả đã tiến hành phân tích toàn bộ protein của phôi nang và tập trung vào các enzyme liên quan đến quá trình chuyển hóa lactate. Kết quả cho thấy nhiều protein tham gia vào các quá trình như đường phân, con đường pentose phosphate (PPP) và chu trình Krebs (TCA) có sự thay đổi ở phôi IVF so với phôi tự nhiên.
 
KẾT LUẬN
Nghiên cứu này tập trung phân tích giai đoạn phôi nang. Các nghiên cứu tiếp theo nên mở rộng phạm vi, xem xét sự biến đổi về chuyển hóa, ROS và tổn thương oxy hóa xuyên suốt các giai đoạn phát triển sớm của phôi, cả ở loài chuột và người. Mặc dù môi trường nuôi cấy thương mại đã được chứng minh là gây ra stress oxy hóa cho phôi, ngay cả trong điều kiện nồng độ oxy thấp, việc thiết kế môi trường nuôi cấy tối ưu để giảm thiểu ROS vẫn là một hướng đi cần được ưu tiên. Bên cạnh đó, việc phụ thuộc quá nhiều vào kỹ thuật kính hiển vi huỳnh quang trong đánh giá các chỉ số oxy hóa và biểu hiện protein có thể là một hạn chế của nghiên cứu.
 
Tài liệu tham khảo: Lee, S. H et al (2022). Murine blastocysts generated by in vitro fertilization show increased Warburg metabolism and altered lactate production. eLife, 11, e79153.

Từ khóa: thụ tinh trong ống nghiệm, stress oxy hoá, warburg, ROS, phôi nang.